Światło białe wg teorii Maxwella jest elektromagnetycznym ruchem falowym. Fale świetlne różnią się od fal radiowych tylko długością; jedne i drugie rozchodzą się z tą samą prędkością c=3*108m/s. Promienie Röntgena i gamma przynależą do fal elektromagnetycznych. Światło białe obejmuje światło widzialne i niewidzialne. Światło widzialne w tym zakresie obejmując od 3800 Å do 7700 Å jest niewielkim wycinkiem. Z obu tych stron rozciąga się światło niewidzialne – podczerwone (IR) 7700 Å - 3μm i 3 – 100μm (bliska i daleka podczerwień) i nadfioletowe (UV) 1300 – 3800 Å oraz 1300 – 100 Å (bliski i daleki nadfiolet). Oko ludzkie najbardziej wrażliwe jest na długość ok 5500 Å. Średnio przyjmuje się do wszelkich matematycznych obliczeń 5500 Å.
Podstawowym narzędziem badawczym w histologii jest mikroskop. Określa się zdolność rozdzielczą mikroskopu oraz powiększenie mikroskopu. Zdolność rozdzielcza to widzenie najbliżej leżących obok siebie przedmiotów jako jeszcze dwa oddzielne.
A=η*sinα, A- apertura numeryczna
1/d=λ/2A, d – najmniejsza odległość między obiektami, przy której jeszcze są one rozróżniane pod mikroskopem Teoretyczna d dla mikroskopów suchych ok 0,3μm; dla olejkowo – immersyjnych ok. 0,19 μm
Powiększenie mikroskopu = powiększenie okularu x powiększenie obiektywu.
Obraz powstały w mikroskopie jest: pozorny, powiększony i odwrócony, podobnie jak obrazy odbierane z soczewki.
Mikroskop składa się z zespołu mechanicznego i zespołu optycznego. Zespół mechaniczny: podstawa mikroskopu, statyw, stolik pomiarowy, tubus, urządzenie rewolwerowe, śruby mikro i makrometryczne. Zespół optyczny: źródło światła, filtry, przesłona, kondensor, obiektyw, pośrednie układy optyczne (pryzmaty), okulary.
Soczewki i ich układy są obarczone szeregiem wad, czyli tzw. aberracjami: chromatyczną, sferyczną i astygmatyzmem. Tzw. szkło kronowe i flintowe zmniejszają znacznie wadę chromatyczną.
Stosujemy różne rodzaje mikroskopów w zależności od tego, co chcemy uzyskać. W preparatach stałych znajdują się już martwe komórki, jednak czasem chcemy oglądać pewien proces, dynamikę procesu, stąd też różnorodność mikroskopów.
Rodzaje mikroskopów:
- mikroskop fazowo – kontrastowy
- mikroskop polaryzacyjny
- mikroskop interferencyjno – polaryzacyjny
- mikroskop z kondensorem ciemnego pola
- mikroskop fluorescencyjny
- mikroskop dla podczerwieni
- mikroskop holograficzny
- mikroskop stereoskopowy
- mikroskop elektronowy
Mikroskop polaryzacyjny:
Posiada wbudowane w układ optyczny dwa pryzmaty Nikola lub siatki polaryzacyjne (polaryzator i analizator), powodujące polaryzację światła. Jesteśmy wtedy w stanie zobaczyć, czy w danej strukturze zachodzi ugięcie. Inaczej odbija się promień od nieregularnie ułożonego elementu, a inaczej od obiektu o ułożeniu regularnym. Obiekty przejrzyste można podzielić na izotropowe (pojedynczo załamujące światło) i niewidoczne w tym mikroskopie oraz anizotropowe(podwójnie załamujące światło) i widoczne jako obiekty jasne na ciemnym tle. Pewne substancje charakteryzują się tym, że są anizotropowe bądź izotropowe. W kościach znajdują się beleczki kostne, które mogą być ułożone regularnie bądź nie, prawidłowe lub nieprawidłowe i to wszystko można określić dzięki mikroskopowi polaryzacyjnemu. W diagnostyce histopatologicznej stosowany m.in. do ujawniania złogów amyloidu wybarwionych czerwienią Kongo, lipidów.
Mikroskop kontrastowo – fazowy
Promień świetlny przechodząc przez daną strukturę ulega przesunięciu w fazie sinusoidalnej, świetlnej, co dla oka ludzkiego jest niewidoczne. Widoczna jest natomiast zmiana natężenia. Wstawienie płytki fazowej powoduje, że przesunięcie w fazie zamienia się w zmianę natężenia (zmiana amplitudy widoczna jako odpowiedni stopień jasności). Pozwala to na oglądanie preparatów niebarwionych, żyjących. Struktury widoczne są jako ciemniejsze i jaśniejsze.
Mikroskop interferencyjno – polaryzacyjny:
W mikroskopie z urządzeniem interferencyjno-polaryzacyjnym można w ułamkach długości fali świetlnej mierzyć przesunięcia fazowe światła przechodzącego przez badane struktury. Umożliwia badanie ilościowe (większość mikroskopów pozwala jedynie na badanie jakościowe), czyli badania o pomiarze suchej masy komórkowej. Przyjmuje się stałe nawodnienie – ok. 85% w każdej komórce. By zważyć komórkę, potrzeba mieć pewne parametry: parametry powierzchniowe mamy, nie znamy jedynie wysokości. Podczas przepuszczania spolaryzowanych promieni przez daną strukturę, dochodzi do zjawiska interferencji, czyli wzmocnienia, bądź wygaszenia fali świetlnej. Wygaszenie/wzmocnienie przechodzi na widmo białe, przez co uzyskuje się kolorystykę. Uzyskanie barwnego obrazu pozwala na pomiar wysokości, gdyż znamy odległość między np. kolorem zielonym a czerwonym. Wykorzystując różne parametry i specjalne głowice uzyskuje się pomiar suchej masy komórkowej.
Mikroskop z optyka Nomarskiego:
Jest optyką mikroskopu kontrastowo – fazowego i interferencyjnego, ale wzmacnia on kontury (kontrast niezabarwionych struktur) i pozwala na uzyskanie plastycznego, prawie trójwymiarowego obrazu.
Mikroskop z kondensorem ciemnego pola:
Umożliwia oglądanie niebarwionych struktur z zastosowaniem zwykłego mikroskopu i kondensora ciemnego pola. Powoduje on większe zjawisko dyfrakcji, czyli ugięcia. Im bardziej ugnie się promień, tym lepiej jest on widoczny. W mikroskopie z kondensorem ciemnego pola promień ten jest jaśniejszy, natomiast w mikroskopach z opuszczonym kondensorem jest on ciemniejszy na jasnym tle. Stąd mając zwykły mikroskop również jesteśmy w stanie zobaczyć niebarwione preparaty, jeśli opuścimy kondensor, aby zwiększyć ugięcie promieni świetlnych. Mikroskop taki umożliwia obejrzenie struktur o wymiarach poniżej zdolności rozdzielczej układu optycznego. Możemy w nim obejrzeć m.in. plemniki żywe i martwe. Metodę ciemnego pola stosuje się głównie do obserwacji mikroorganizmów obecnych w płynach ustrojowych.
Mikroskop fluorescencyjny:
Umożliwia obejrzenie czegoś, co jest trudne do obejrzenia: antygenów, przeciwciał.
System oświetlenia preparatu:
-diailuminescencyjny (od dołu)
-epiluminescencyjny (od góry)
Fluorescencja własna: lipofuscyna, porfiryny, witamina A, chlorofil
Fluorochromy: oranż akrydyny, fluoresceina, rodamina.
Znakowanie materiału metodą immunofluorescencji bezpośredniej lub pośredniej.
Fluorochrom pod wpływem promieniowania UV zaabsorbowanego w ciągu dnia zaczyna świecić. Poprzez zastosowanie tych substancji w mikroskopie uzyskujemy „efekt widzialny dzięki zastosowaniu niewidzialnych promieni”. Jeden fluorochrom może zabarwić kilka struktur: inaczej barwi się jądro, inaczej cytoplazma. Stosowany jest również w immunofluorescencji. By określić, czy dany antygen występuje w komórce, podaje się płynny preparat z immunoglobuliną swoistą z dołączonym fluorochromem do przeciwciała. Znajduje się tu fluoresceina lub witamina B12(?) – to najczęściej stosowane fluorochromy. Stosujemy akurat te, aby nawet IV-rzędowa struktura białka w immunoglobulinie nie uległa zmianie. Immunoglobulina tworzy w miarę trwałe połączenie z antygenem. Następnie wypłukuje się i pozostaje efekt połączenia w postaci świecenia. Świadczy ono o tym, że w tym miejscu znajduje się antygen. Gdy szukamy przeciwciała działamy odwrotnie, czyli podajemy znakowany antygen. W ten sposób diagnozowanych jest wiele jednostek chorobowych.
Mikroskop konfokalny:
Umożliwia oglądanie obrazów w 3D a także warstwową obserwację. Istotna jest kwestia pomiaru. Pozwala również na obserwację organizmów żywych. Obecnie używa się głównie 3 typów mikroskopów konfokalnych:
-skanujące laserowe mikroskopy konfokalne, których laserowy promień skanuje pole po polu
-mikroskopy konfokalne z wirującym dyskiem
-PAM (Programmable Array Microscopes)
Mikroskop transmisyjny:
Zastosowanie strumienia elektronów, który jest krótką falą, automatycznie zmniejsza zdolność rozdzielczą, a tym samym poprawia jakość oglądanego obrazu. Katoda(-) emituje strumień elektronów; jest on następnie przyspieszany przez anodę(+). Stosuje się soczewki elektromagnetyczne. Przykładając minus odpychamy wiązkę elektronów, przykładając plus – przyciągamy. W ten sposób strumień jest formowany. Elektrony przechodzą przez preparat umieszczony na siateczce, a na ekranie fluorescencyjnym uzyskujemy określony efekt powiększenia.
Mikroskop skaningowy:
Posiada skaner, który na zasadzie ruchu....... biegnie po powierzchni, dając efekt mikroskopu elektronowego. Tu również zastosowana jest wiązka elektronów. Różni się od m. transmisyjnego tym, że umożliwia obejrzenie powierzchni komórki, a wiązka odbija się od preparatu.
Rodzaje preparatów mikroskopowych:
- skrawki
- szlify, np. kość, zębina
- rozmazy
- rozgnioty, gdy zależy nam np. na komórkach z danego preparatu a nie na preparacie jako całości. nie liczy się wygląd ogólny preparatu
- odciski narządowe, np. szpik, gdy chcemy zobaczyć jądra komórek w nim zawartych
- hodowle komórkowe, np. przeszczep
Metodyka przygotowywania preparatów do mikroskopii świetlnej:
1. Pobieranie materiału – ok. 1 cm dla mikroskopii świetlnej, elektronowa – ok. 1 mm
2. Utrwalanie – zatrzymanie mechanizmów życia komórki, które podporządkowane są enzymom. Zablokowanie apoenzymu blokuje cały enzym. Utrwalacze możemy podzielić na proste i złożone. W utrwalaczach złożonych każdy ze składników ma określoną czynność. Przy wyborze utrwalacza wybieramy taki, który najlepiej utrwali badaną przez nas strukturę i w najszybszym czasie.
Dobry utrwalacz:
- szybko przenika w głąb tkanki
-powoduje szybką koagulację ciał białkowych, ale niezbyt gwałtownie
-jest izotoniczny w stosunku do płynów tkankowych
Utrwalacze proste: kwasy mineralne (azotowy, siarkowy, trójtlenek chromu, czterotlenek osmu), kwasy organiczne (mrówkowy, octowy, trojchlorooctowy, pikrynowy) i inne (etanol, metanol, propanol, aceton, formalina, aldehyd szczawiowy), sole metali ciężkich (sublimat=dwuchlorek rtęci, sole ołowiu azotan lub octan, cynku)
Utrwalacze złożone: Carnoya (etanol, chloroform, kwas octowy lodowaty), Bakera (formalina, chlorek wapnia, woda destylowana), Susa (sublimat, chlorek sodu, woda destylowana), Zenkera-Helly’ego (dwuchromian potasu, sublimat, kwas octowy lodowaty), Buina (kwas pikrynowy, formalina, kwas octowy lodowaty, kwas trójchlorooctowy)
3. Odwodnienie utrwalonych tkanek: 50 – 100% alkohol
4. Zatapianie w parafinie – nadaje twardość tkankom. Przed parafiną płyny pośrednie (benzen, toluen) – konieczne, ponieważ alkohol nie łączy się z parafiną; w metakrylanie dla ME
5. Krojenie – mikrotomy saneczkowe, korbowe
6. Nawodnienie: 100 – 50% alkohol. Nawadniamy, bo barwniki potrzebują wody.
7. Barwienie –
metoda progresywna (rozcieńczone barwniki i barwienie w ciągu dłuższego czasu 12 – 24 godz. ) - barwienie czyste i selektywne;
metoda regresywna (stężone barwniki i krótki okres barwienia) – nierównomierne barwienie, możliwość przebarwienia i zabarwienia nieswoistego
hematoksylina (najczęściej Hematoksylina Mayera lub Ehrlicha) wyciąg z amerykańskiego drzewa Erytroxylon Campechianum – barwienie jąder komórkowych
eozyna (barwienie kwaśne, plazmatyczne)
8. Odwodnienie: 50 – 100% alkohol, płyny pośrednie
9. Zatapianie preparatów na stałe: syropy, żele (glicerożelatyna [żelazo + glicerol]), żywice – balsam kanadyjski
Przygotowanie preparatu trwa ok. 2 tygodni.
Przygotowywanie preparatów w mikroskopii elektronowej:
Różnica: jest raczej ............. i należy przeciąć preparat na znacznie cieńsze skrawki niż w mikroskopii świetlnej. Parafina nie jest na tyle twardą substancją, by pozwalała na wykonanie takiego preparatu. Utwardzamy preparat w żywicach i stosujemy do krojenia nóż diamentowy, który pozwala na uzyskanie skrawków rzędu dziesiątych części mikrometra. Zamiast typowych barwników, jakie stosujemy w mikroskopii świetlnej używa się tu soli metali ciężkich (Os, Mn, Pb), które nie przepuszczają elektronów. Próbki utrwalane są w glutaraldehydzie(?)nazywamy to kontrastowaniem.............. barwieniem, bo np. czterotlenek osmu spełnia kilka funkcji: nie dość, że utrwala to jeszcze zabarwia. Następnie preparaty krojone są na ultramikrotomie z nożem diamentowym. Gotowe skrawki układa się na siateczkach i wkłada do mikroskopu.
Gdy niezbędne jest szybkie wykonanie badań histopatologicznych, np. w czasie wykonywania operacji, możemy pominąć pewne etapy przygotowania preparatu do badań. Zamiast użycia utrwalacza możemy zmrozić badany fragment. Są to techniki mrożeniowe. Po zamrożeniu próbkę od razu kroimy i szybko barwimy. W ten sposób w ciągu kilku minut możemy np. przekazać operatorowi informację czy jest zmiana nowotworowa, czy też nie.
Przy rozróżnianiu struktur oglądanych pod mikroskopem nie kierujemy się zabarwieniem poszczególnych fragmentów, ale cechami morfologicznymi tam występującymi.
Zjawisko metachromazji:
Polega na tym, że barwione struktury zostają zabarwione innym kolorem niż kolor barwnika użytego do barwienia. Ze zjawiskiem tym ma się do czynienia np. przy barwieniu mukopolisacharydów w chrząstce – siarczanu chondroityny, albo komórek tucznych, których ziarnistości barwią się metachromatycznie ze względu na zawartość heparyny. Do barwienia metachromatycznego używa się np. błękitu toluidyny, który daje różowofioletowe zabarwienie struktur metachromatycznych. Jest to spowodowane tym, że barwnik układa się na zabarwionych metachromatycznie cząsteczkach w sposób uporządkowany, wskutek czego powstają jego dimery inaczej absorbujące widmo światła białego niż monomer. Jest to barwienie np. barwnikiem niebieskim na kolor czerwony.
Barwienie polichromatyczne:
Barwienie z użyciem wielu barwników mających różny efekt. Poszczególne barwniki działają na specyficzne organelle. Do barwień najczęściej stosowanych w diagnostyce hematologicznej należy barwienie polichromatyczne mieszaniną barwników zasadowych i kwaśnych. Barwienia takie wykonuje się też w diagnostyce wymazów komórkowych z różnych błon śluzowych.
Barwienie przyżyciowe:
błękit metylenowy, błękit toluidyny, błękit Nilu
Bardzo istotne jest, by przy oglądaniu preparatów zwrócić uwagę na miejsce przekroju. Normalne jądro komórkowe zajmuje ok ¼ - 1/3 całej komórki. Zdarza się, że zajmuje ono nawet 2/3. Należy wtedy sprawdzić, czy jest to wynik przekroju, czy może nieprawidłowość, co szczególnie istotne jest w chorobach nowotworowych.
Artefakty – obrazy morfologiczne, które normalnie nie występują, a są wynikiem obróbki. Są to np.: włókna, nałożenie się, rozerwanie, oderwane struktury.
Techniki mrożeniowe:
Polegają na utwardzeniu materiału biologicznego poprzez jego zamrożenie.
Zalety: są krótkotrwałe, zachowują wszystkie składniki w materiale biologicznym, procedura przebiega w niskiej temperaturze co zapobiega denaturacji białek.
Materiał zamraża się:
- w ciekłych gazach: azot (-196°C), freon, izopropan, hel (-269°C)
- za pomocą zestalonego dwutlenku węgla, tzw. suchy lód (-78,5°C)
Krioprojekcja polega na przepojeniu materiału roztworem sacharozy (15-30%) lub gliceryny (10-30%) lub DMSO (10%) w celu uniknięcia krystalizacji wody podczas zamrażania.
Materiał zamrożony kroi się na: mikrotomie mrożeniowym, kriostacie.
Liofilizacja: proces suszenia zamrożonego materiału biologicznego w próżni oraz w obniżonej temperaturze na drodze sublimacji wody. Metoda ta pozwala na zachowanie w tkance wszystkich substancji chemicznych.
Badanie histochemiczne:
Czasem prócz wyglądu komórki interesuje nas, jakie substancje ona zawiera. Za pomocą reakcji histochemicznych można identyfikować: kwasy nukleinowe, wielocukry, tłuszczowce, z mniejszą dokładnością białka, a także barwniki i niektóre składniki nieorganiczne. Przez wykazanie różnic w składzie chemicznym komórek leżących obok siebie lub zmian wywołanych działającymi na nie czynnikami, reakcje te mogą stanowić wskaźnik stanu czynnościowego komórki. W nielicznych tylko przypadkach reakcje histochemiczne mogą stanowić również podstawę do obliczeń ilości badanej substancji. Obliczenia takie opierają się na prostej zależności między ilością barwnego produktu reakcji a stężeniem badanej substancji w tkance. Ilość produktu reakcji warunkuje z kolei stopień pochłaniania monochromatycznego światła, o odpowiednio dobranej długości fali, przepuszczonego przez zabarwiony obszar tkanki.
Węglowodany – przy ich określaniu wykorzystujemy głównie wiązania redukcyjne. Metoda ich wykrywania to metoda p.a.S., gdzie leukofuksyna (substancja bezbarwna) pod wpływem redukcji zabarwia się na kolor amarantowy ;). W celu uwidocznienia umiejscowienia wielocukrów w komórkach i w tkankach stosuje się metodę, w której wykorzystuje się kwas nadjodowy i odczynnik Schiffa, czyli tzw. metoda p.a.S. Ogólną podstawą chemiczną tej metody jest względnie swoiste rozrywanie wiązania między atomami węgla w cząsteczce glikogenu i utlenianiu związanych z tymi węglami grup 1,2-glikolowych na grupy aldehydowe. Powstały stąd dwualdehyd łączy się z leukofuksyną odczynniki Schiffa dając trwałe, purpurowoczerwone zabarwienie. W związku z tym, że tego rodzaju grupy 1,2-glikolowe występują i w innych związkach, a ponadto kwas nadjodowy utlenia również do grup aldehydowych grupy 1,2-glikoaminowe, alkiloaminowe i ketonowe innych niż wielocukry związków – w każdym przypadku przed wykonaniem zasadniczego odczynu przeprowadza się na drugim skrawku, kontrolne trawienie enzymatyczne roztworem diastazy swoiście rozkładającej tylko glikogen.
Lipidy – barwienie Sudanem I, II, III, czterotlenkiem osmu. W technice przygotowania preparatów z lipidami należy unikać alkoholi oraz płynów pośrednich – technika mrożeniowa. Ze stosowanych metod histochemicznych na lipidy najczęściej używanymi w praktyce są metody oparte o tzw. barwniki lipidowe, do których należy cały szereg Sudanów i czerwień oleista barwiące przede wszystkim lipidy zapasowe i metaboliczne. Spośród innych metod histochemicznych na lipidy należy wymienić barwienie z użyciem Błękity Nilu oraz barwienie czterotlenkiem osmu. Metoda z czterotlenkiem osmu jest szczególnie przydatna do orientacyjnego rozróżnienia lipidów w mikroskopie elektronowym, gdzie związek ten jest jednocześnie często stosowanym utrwalaczem.
Białka i aminokwasy – jak dotąd nie ma pewnych i swoistych odczynów histochemicznych na poszczególne białka i aminokwasy. Stosowana dość powszechnie metoda bromofenolowa pozwala jedynie na ogólne zorientowanie się w „zawartości” białek w komórce, ale bez możliwości rozróżnienia nawet czy chodzi tu o białka proste, czy złożone.
Kwasy nukleinowe – RNA – metoda Bracheta (zieleń metylenowa i pirolina); DNA – metoda Feuglena.
Reakcja Feuglena: dwuetapowa reakcja służąca do wykrywania DNA. W pierwszym etapie tkankę poddaje się hydrolizie w 1N kwasie solnym, co powoduje pęknięcie pierścienia pentozowego dezoksyrybozy i wytworzenie grupy aldehydowej. W drugim powstałe grupy aldehydowe uwidacznia się odczynnikiem Schiffa.
Metoda Bracheta: służy do różnicowanego wykrywania DNA i RNA w tym samym materiale za pomocą mieszaniny zieleni metylenowej (DNA) i pironiny (RNA). Efektem reakcji jest zabarwienie jąderka na czerwono i zielonofioletowa chromatyna jądrowa.
W określaniu enzymów nie możemy zidentyfikować ich bezpośrednio, ale możemy badać efekt, jaki wywołały. Metoda prosta: substrat po reakcji charakterystycznej dla danego enzymu daje produkt barwny. Gdy substrat i produkt są bezbarwne używa się jonowymienników chemicznych barwiących produkt reakcji. Jest to tzw. reakcja enzymatyczna złożona. Musi być ona szybka, szybsza niż np. działanie lityczne enzymów aparatu Golgiego. Fosfataza kwaśna i zasadowa. Są one wyjątkami, gdyż tu kolorystyka świadczy o obecności enzymów i aktywności. Pirofosfataza – marker aparatu Golgiego. Marker – charakterystyczny enzym dla danej struktury. Gdy oceniamy struktury możemy: 1. Obejrzeć ją pod mikroskopem świetlnym 2. Zabarwić 3. Oznaczyć na podstawie markerów enzymatycznych.
Badanie cytoenzymologiczne:
Reakcje histochemiczne przeprowadza się na skrawkach kriostatowych lub parafinowych, rzadziej na niewielkich fragmentach tkanek. Skrawki poddaje się inkubacji w środowisku zawierającym odczynnik reagujący wybiórczo z poszukiwaną substancją. Ostateczny produkt reakcji, w celu uwidocznienia go w tkance, musi być nierozpuszczalny i barwny, lub elektronowo gęsty w przypadku oglądania materiału w mikroskopie elektronowym.
R. histoenzymatyczna prosta:
substrat -> enzym -> produkt barwny
R. histoenzymatyczna złożona (met. Jonowymienników chemicznych)
substrat -> enzym -> produkt -> reakcja wiązania -> barwnik
R. histoenzymatyczna powinna:
-być szybka, aby uniknąć błędów wywołanych dyfuzją produktów
- dawać jako produkt niekrystaliczny drobnoziarnisty strąt
Wytworzony strąt nie powinien rozpuszczać się w płynie inkubacyjnym, powinien natomiast wykazać możliwie duży molowy współczynnik ekstynkcji, aby zapewnić wysokie nasilone barwy. Ilość powstającego strątu powinna być możliwie ściśle skorelowana z aktywnością badanego enzymu.
Reakcja Gomoriego:
Służy do wykrywania hydrolaz. Reakcja polega na rozszczepianiu substratu przez wykrywany w tkankach enzym. Następnie na wytrąceniu jednej ze składowych rozszczepionego substratu jonami metali (Ca2+, Pb2+, Cu2+, Ba2+, Co2+). Powstaje nierozpuszczalna sól. Większość z tych soli jest widoczna w mikroskopie elektronowym, natomiast do celów mikroskopii świetlnej czasami należy przeprowadzić dodatkową reakcję barwną.
Tiaminowa pirofosfataza – marker struktury Golgiego
odczyn „konturuje” układ cystern i wakuoli, jest intensywny w komórkach wydzielniczych i nerwowych. W miejscu lokalizacji enzymu stwierdza się intensywne czarne strąty siarczku ołowiu.
Dehydrogenaza bursztynianowe – marker błony mitochondrialnej
DB odcina od substratu ( soli sodowej kwasy bursztynowego) atomy wodoru, które następnie łączą się z solą tetrazolową Nitro TB dając barwne złogi formazanu.
Fosfataza kwaśna – marker lizosomów
W komórkach wątroby lizosomy układają się głównie w biegunach żółciowych.
Immunohistochemia:
Metoda polegająca na wykrywaniu w komórkach i tkankach substancji o charakterze antygenowym za pomocą znakowanych przeciwciał. Przeciwciała znakuje się fluorochromami, enzymatycznie, ferrytyną lub złotem koloidalnym.
Podstawowe typy reakcji immunohistochemicznych:
- bezpośrednia (antygen – znakowane przeciwciało)
- pośrednia (antygen – nieznakowane przeciwciało – znakowana antyglobulina)
- z mostkami immunoglobulinowymi i kompleksami enzym-antyenzym (antygen – przeciwciało – antyglobulina – kompleks enzym/antyenzym)
Metoda immunoenzymatyczna:
A badaniach immunologicznych z zastosowaniem fluorescencji wadą jest to, że struktury wraz z biegiem czasu przestają emitować światło. Rozwiązaniem tego jest metoda immunoenzymatyczna. W miejsce fluorochromu są układy enzym – antyenzym.
Autoradiografia:
Czasem chcemy określić, jaka jest chłonność określonej substancji przez dane komórki. Substancje te znakujemy substancjami promieniotwórczymi. Po pewnym czasie substancja ta znajduje się w różnych miejscach w różnej ilości. Metoda ta używana jest do określenia działania leków, przy poznawaniu powstawania pewnych struktur, poszukiwaniu aminokwasów. Używa się masy koloidowej działającej jak błona fotograficzna i poddaje obróbce.
Metoda badawcza umożliwiająca lokalizację izotopów promieniotwórczych lub znakowanych nimi substancji w komórkach lub tkankach. Podane in vivo substancje promieniotwórcze zostają włączone w normalny ciąg procesów metabolicznych. Po przygotowaniu preparatów mikroskopowych w sposób typowy pokrywa je się żelem zawierającym AgBr. Promieniowanie powoduje rozpad tej soli i pojawienie się metalicznego srebra, które po wywołaniu i utrwaleniu można obserwować w mikroskopie. Pozwala na śledzenie dynamiki procesów metabolicznych w komórkach i tkankach.
Cytometria przepływowa:
metoda szybkiego obliczenia ilości danej substancji. Np. badanie morfologiczne krwi. Cytofotometr ustawia się na określone struktury, wielkości, wyglądy(?), przepuszcza się płyn i wylicza. Można stosować tu też znaczniki fluorescencyjne dla dokładniejszych wyników.
Technika pomiaru właściwości fizycznych i chemicznych komórek z zastosowaniem przyrządu, który w krótkim czasie może przebadać dużą populację komórek. Badane komórki muszą być zawieszone w płynnym środowisku jako zawiesina oddzielnych komórek. Komórki używanie do tych badań są uprzednio zabarwiane barwnikami fluorescencyjnymi. Istnieje cała grupa odczynników fluorescencyjnych, które swoiście wiążą się z takimi składnikami komórkowymi, jak DNA, RNA czy powierzchnią komórki.
W chwili przepływu przez rejon pomiaru komórka przechodzi przez wąski promień światła, który ulega rozproszeniu zależnemu od wielkości, kształtu lub właściwości optycznych komórki oraz wzbudza fluorescencję substancji chemicznych, którymi komórka była uprzednio znakowana.
Odczyty w każdej komórce są następnie liczone i analizowane statystycznie przez komputer. Metoda ta pozwala na przebadanie w krótkim czasie wielu parametrów w bardzo dużej liczby komórek.
Mikrochirurgia:
Narzędziami są: mikroigły, mikroskalpele, mikropipety. Są one poruszane za pomocą mikromanipulatora, który tak redukuje zakres ruchów ręki, że narzędzia można prowadzić w polu widzenia mikroskopu. Dzięki tej technice można usuwać z komórek jądra oraz wprowadzać inne. Dzięki temu wiemy, że jądro zróżnicowanej komórki nabłonka jelita wprowadzone do komórki jajowej, po pobudzeniu jej do rozwoju, może dać początek całemu normalnemu organizmowi.
Mikromanipulatorem można wprowadzać substancje, wstrzykując je bezpośrednio do komórki i omijając ich działanie na receptory błony komórkowej.
Narzędziem mikromanipulatora może też być skoncentrowana wiązka promieniowania UV lub promieniowania laserowego. Za pomocą wiązek światła można selektywnie niszczyć w komórce wybrane obszary komórki lub jej narządy.
Hodowla:
Jest to utrzymanie oddzielonych od organizmu komórek, tkanek, narządów w warunkach sztucznych przez okres dłuższy niż 24h. Inkubacja – poniżej 24h.
Hodowlę prowadzi się na pożywkach. Komórki lub tkanki mogą być w niej zanurzone całkowicie, bądź znajdować się na jej powierzchni.
Wyróżnia się:
- hodowlę komórek; in vitro: hoduje się zarodek ludzki ok 48h i po uzyskaniu stadium gwarantującego wszczepienie się zarodka do błony śluzowej wprowadza się do macicy.
- hodowlę tkanek
- hodowlę organotypową ( embrionalne zawiązki narządów lub całych bądź fragmentów narządów pobranych z dojrzałego organizmu); np. przeszczepy, głownie skóry. Hetero- i autohodowle.
Ilościowa analiza obrazów mikroskopowych:
Zobiektywizowany opis obrazów mikroskopowych zarówno z mikroskopów świetlnych, jak i elektronowych, czyli techniki pomiarowe, które pozwalają na numeryczny opis obrazów mikroskopowych, a następnie na ocenę tych pomiarów metodami statystycznymi.
Lizosomy
Oznacznikami enzymatycznymi dla lizosomów są następujące enzymy: fosfataza kwaśna, rybonukleaza, dezoksyrybonukleaza II, katepsyny i Β-glikuronidaza. Wszystkie te enzymy wykrywane są w lizosomach tak metodami biochemicznymi, jak i histochemicznymi.
Aparat siateczkowaty Golgiego
Enzymatycznym oznacznikiem dal aparatu Golgiego jest tiaminowa pirofosfataza. Wykonanie odczyny histochemicznego na ten enzym tak dokładnie „konturuje” układ beleczek i wakuoli aparatu Golgiego, że z powodzeniem zastąpić może dotychczas stosowane wybarwianie tej organelli metodami histologicznymi opartymi na srebrzeniu.
Chondrion komórkowy
Enzymatycznymi oznacznikami dla chondrionu komórkowego biorącego bezpośredni udział w procesach oksydoredukcyjnych i w tlenowej fosforylacji są odpowiednio dehydrogenaza kwasu bursztynowego i adenozynotrójfosfataza mitochondrialna.
Teoretycznie, oznacznikami enzymatycznymi dla tej organelli mogą być prawie wszystkie enzymy biorące udział w tych procesach (m.in. prawie wszystkie wchodzące w cykl Krebsa), praktycznie, metodami histochemicznymi wykrywane jest ich kilkanaście, a wśród nich najczęściej w tym celu stosowane są właśnie metody na wyżej wymienione dwa enzymy.
Podstawą odczyny histochemicznego metody Nachlasa i współpr. na dehydrogenazę kwasu bursztynowego jest odłączenie przez enzym z substratu (sól sodowa kw. Bursztynowego) dwu atomów wodoru, które łącząc się z solą tetrazolową Nitro BT dają produkt końcowy w postaci barwnych złogów formazanu w miejscach aktywności tego enzymu. „Konturowanie” chondriomu komórkowego przez tę dehydrogenazę jest wyjątkowo precyzyjne ze względu na umiejscowienie enzymu na błonach bądź w samych błonach tej organelli.
Istnieją też możliwości barwienia mitochondrium zielenią Janusową lub hematoksyliną żelazistą.