2011-04-19

TESTY IMMUNOHISTOCHEMICZNE

Reakcje immunoenzymatyczne:

1.

Reakcja

bezpośrednia

–

najmniej

czasochłonna,

wymaga

zastosowania

znakowanego przeciwciała; znajduje zastosowanie do wykrywania Ig, dopełniacza i kompleksów immunologicznych

antygen

przeciwciało

enzym

tkanka

2. Reakcja pośrednia – jest to procedura dwuetapowa: A) inkubacja tanki ze swoistym nieznakowanym przeciwciałem; B) lokalizacja związanego przeciwciała drugim znakowanym przeciwciałem (antyglobuliną) 3. Reakcja z kompleksem enzym-antygen – jest to procedura trzyetapowa: A) Inkubacja ze swoistym nieznakowanym przeciwciałem; B) Inkubacja z nieznakowaną antyglobuliną (pełni rolę mostka łączącego przeciwciało nieznakowane z antyenzymem);

C) Inkubacja z enzymem znacznikowym skoniugowanym z przeciwciałem przeciwko temu enzymowi (antyenzym);

Bardzo czuła metoda, pozwala na zastosowanie stosunkowo niskiego stęż enia przeciwciał pierwszych (swoistych) 1

2011-04-19

Odmiany testów ELISA

1. Test podwójnego wiązania – służy zwykle do określania stężenia danego białka (antygenu) w badanej próbie

ETAPY:

A) umieszczenie

specyficznego

względem

danego antygenu przeciwciała na fazie stałej, np. płytce

B) po wypłukaniu przeciwciał, które nie związały się z płytką, dodaje się materiał

badany; ponownie przepłukuje się płytkę w celu pozostawienia przeciwciał związanych z antygenem (o ile był on obecny w próbie) C)

następnie

dodawane

jest

kolejne

przeciwciało, tym razem wyznakowane

enzymem

specyficzne

względem

poszukiwanego

antygenu,

jednak

rozpoznające

inny

region

cząsteczki

białkowej - dzięki temu przeciwciało użyte do wychwycenia antygenu nie blokuje

przeciwciała znakowanego enzymem

D) po przepłukaniu dodaje się substratu dla enzymu związanego z przeciwciałem w

wyniku

reakcji

enzymatycznej

przechodzącego

w

barwny

produkt

(wykrywany

np.

metodami

kolorymetrycznymi, fluorescencyjnymi) 2. Test bezpośredni – wykrywania antygenu, tzn.

wykrywanie go za pomocą jednego tylko przeciwciała, 2

2011-04-19

3. Test pośredni – przeciwciało monoklonalne rozpoznające swoiście antygen (przeciwciało pierwszorzędowe, ang. primary antibody) nie jest znakowane. Znakowane jest natomiast przeciwciało

drugorzędowe

(ang.

secondary

antibody)

przyłączające

się

do

przeciwciała

pierwszorzędowego,

rozpoznające dany izotyp immunoglobulin 4. Wykrywanie swoistych przeciwciał testem ELISA – W celu wykrycia przeciwciał należy opłaszczyć fazę stałą antygenem (np. antyHIV), przeciwko któremu skierowane są poszukiwane przeciwciała. Za pomocą drugiego przeciwciała lub innego wyznakowanego ligandu można nie tylko wykryć przeciwciała, ale nawet określić ich klasę.

5. Kompetycyjny test ELISA - wykorzystuje się mieszankę znakowanego antygenu lub przeciwciała, które są dodawane do badanego materiału .

Jeśli na fazę stałą podziała się mieszanką badanej surowicy i specyficznego względem danego antygenu przeciwciała monoklonalnego wyznakowanego enzymem, to nastąpi współzawodnictwo pomiędzy przeciwciałami w surowicy, a przeciwciałem znakowanym.

W odróżnieniu od poprzednich metod natężenie reakcji enzymatycznej będzie odwrotnie proporcjonalne do stężenia przeciwciał w surowicy, gdyż im większe będzie ich stężenie, tym mniej znakowanego przeciwciała przyłączy się do antygenu umieszczonego na fazie stałej.

S

P

S

P

S

P

enzym

enzym

enzym

antygen

antygen

antygen

L

L

L

L

L

L

L

L

3