Biologia zarodków i gamet, wykład 30.04.2014
Zapłodnienie
Penetracja oocytu przez plemnik, zaburzenia procesu zapłodnienia i zapłodnienie heterologiczne

1. Zapłodnienie - proces
- przeciętny ejakulat zawiera wiele mld plemników (buhaj objętość 3-6ml, liczba plemników 7-10mld), po 8-12h w jajowodzie pozostaje do 1000 z nich

Etapy procesu zapłodnienia:
- przejście plemnika przez komórki wzgórka jajonośnego – zapoczątkowanie reakcji akrosomalnej
- przyczepienie się plemnika do osłonki, fuzja i penetracja
- fuzja błon oocytu (witellinowa) i plemnika (jądra)
Zapłodnienie następuje w jajowodzie i I-sze podziały zarodka też.

Zapłodnienie:
- przyczepienie się plemnika do osłonki przejrzystej: zjawisko specyficznie gatunkowo (receptory ZP1, ZP2, ZP3) - plemniki obcogatunkowe mogą się przyczepić ale nie dojdzie do wiązania i fuzji.
- penetracja osłonki: następuje 5-15min. po przyczepieniu: enzymy akrosomu wytrawiają kanalik w osłonce, przez który plemnik wnika do przestrzeni okołożółtkowej.
- blok polispermii = reakcja korowa: po wniknięciu pierwszego plemnika, zawartość ziaren korowych wyrzucana jest do przestrzeni okołożółtkowej (fuzja błon ziaren korowych i oocytu). Zmieniają się właściwości błony oocytu.
Po wniknięciu plemnika, ziarna korowe wraz z błoną witelinową tworzą błonę „zapłodnienia”.
- obecność II ciałek kierunkowych w przestrzeni okołożółtkowej jest dowodem zapłodnienia lub aktywacji oocytu (bydło).
- obecność 2 przedjądrzy w cytoplazmie jest dowodem zapłodnienia lub aktywacji oocytu (człowiek)

Oocyt zdolny do zapłodnienia charakteryzuje się porowatą osłonką. Po zapłodnieniu zaczyna się ona wygładzać.

Jaja chomicze wykorzystuje się do badania chromosomów plemnika.

2. Zdolność gamet do zapłodnienia
- gamety zachowują zdolność do zapłodnienia przez określony czas specyficzny gatunkowo, zależny od okresu trwania rui

Gatunek	Oocyty	Plemniki
Bydło	20-24h	30-48h
Świnia	8-10h	34-72h
…

3. Zaburzenia procesów zapłodnienia
- starzenie się gamet – po utraceniu zdolności do zapłodnienia rozpoczyna się ten proces.
Plemniki tracą zdolność zapładniającą, oocyty degenerują (upośledzenie bloku polispermii, migracja wrzeciona podziałowego do centrum komórki = zaburzenie wyrzucenia II ciałka kierunkowego; degeneracja ooplazmy z utratą zdolności do utworzenia prawidłowego przejądrza męskiego; twardnienie osłonki = ograniczenie penetracji)
- polispermia – prowadzi do powst. zarodków poliploidalnych o ograniczonym potencjale rozwojowym
^ oocyt 1n + 2 plemniki 1n = zarodek 3n (najczęściej)
^ oocyt 1n + 3 plemniki 1n = zarodek 4n (rzadko)
^ oocyt 1n + 2 plemniki 2n = zarodek 4n (b. rzadko)
# częstość występowania in vivo: średnio między 1-2%, wyjątkowo wysoko u świni do 15% (in vitro do 75%).
Zapłodnienie polispermiczne prowadzi do powstania większej niż 2 liczby przedjądrzy i powoduje zaburzenia rozwoju zarodka (zygota człowieka z 3 przedjądrzami – 3PN).

4. Zapłodnienie heterologiczne (zarodki hybrydowe)
- wykorzystanie oocytów innego gat. niż dawca nasienia
- gatunki odległe filogenetycznie – barierę stanowią receptory ZP3 na osłonce przejrzystej oocytu (po usunięciu ZP dochodzi do penetracji i powstania przedjądrzy)
- gat. bliskie filogenetycznie – dochodzi do penetracji oocytów, formowania przedjądrzy i pełnego rozwoju zarodkowo-płodowego
Np. żubronie (krzyżówka żubra z krową bydła domowego). W I-szym pokoleniu samce żubronia są niepłodne (różnica w budowie chromosomu Y i jest problem jest z mejozą).
Po co nam żubronie? Powód kulinarny.

Ocena zdolności zapładniającej plemników:
- udział zygot w stadium przedjądrzy 18h po inseminacji
- zygoty nanoszono na szkiełko podstawowe i utrwalano EtOH, a następnego dnia wybarwiano barwnikiem fluorescencyjnym Hoechst. Preparaty oceniano w mikroskopie fluorescencyjnym.
Zygota nieprawidłowa: wysoki poziom polispermii

5. Pozyskiwanie zarodków hybrydowych – wyniki
- rozwój zarodkowy podejmowało ok. 33% inseminowanych oocytów, mimo że wiele zarodków degenerowało…

ROZWÓJ ZARODKA PRZED IMPLANTACJĄ
Bruzdkowanie, kompakcja, różnicowanie blastomerów, kawitacja blastocyst, ciąże bliźniacze

1. Bruzdkowanie
- szereg podziałów mitotycznych, redukujących objętość komórek potomnych
- zygota podlega procesowi bruzdkowania
- dochodzi do istotnego zwiększenia liczby blastomerów przy jednoczesnej redukcji ich objętości
- 1dzień pi = 1 komórka
- 8dzień pi = 150 – 250 komórek (podobna objętość jak 1 dnia)

2. Aktywacja genomu zarodka – zarodek przechodzi pod własną kontrolę.
- następuje w okresie przedimplantacyjnym w stadium specyficznym gatunkowo (mysz 1-2 blastomerowy zarodek, bydło 8-16 blastomerowy zarodek)
- do tej chwili zarodek wykorzystuje mRNA pochodzenia matecznego
Gdy zarodek osiąga stadium między morulą a blastocystą to dopiero trafia do macicy.

3. Rozwój zarodka in vivo
Zapłodnienie i I-sze podziały zarodka są w jajowodzie do stadium 8-16 blast. Oocyty są transportowane w jajowodzie bez względu na to, czy są zapłodnione (wyjątek – klacz).
Macica – zarodki w stadium 8-16 blast wchodzą do macicy, gdzie podlegają implantacji. (różnie w zależności od gatunku).

4. Kompakcja -> kawitacja -> wylęganie się.
Kompakcja (przyleganie blastomerów) – dotyczy moruli, z luźno ułożonej masy komórek, one wszystkie ścieśniają się i po zajściu kompakcji widzimy masę komórkową. Po kompakcji zaczyna się pojawiać płyn.
Kawitacja – tworzenie się jamy blastocysty wypełnionej płynem.
Wylęganie się – część zarodków nie jest w stanie się wylęgnąć.

5. Kompakcja zarodka
- do stadium 8-blastomerów, komórki są luźno ułożone i stykają się niewielkimi powierzchniami; łatwo je oddzielić po usunięciu z osłonki
- stadium 8-16 blastomerów – powstaje system adhezji komórkowej, blastomery zaczynają oddziaływać, silne przyleganie
- adhezja komórek prowadzi do powstania połączeń ścisłych typowych dla nabłonków; umożliwia to późniejszą kawitację blastocysty
- od stadium 16-blast. Rozpoczyna się proces różnicowania, powstają 2 typy komórek:
* powierzchniowe (spolaryzowane) – stykające się z osłonką przejrzystą zarodka, pokryte mikrokosmkami, z nich powstaje trofoblast
* wewnętrzne (niespolaryzowane) – stykające się tylko z innymi blastomerami, z nich powstaje węzeł zarodkowy (ICM)

Hipoteza inside outside

6. Kawitacja – tworzy się jama blastocysty – w przestrzeniach międzykomórkowych pojawiają się szczeliny, które zaczynają wypełniać się płynem i łączą się tworząc jedną dużą blastocystę.

Pompa sodowo potasowa – utrzymuje różnice stężeń jonów po obu stronach błony i potencjał spoczynkowy, nigdy nie dochodzi do wyrównania stężeń jonów po obu stronach żywej błony komórkowej. Stężenie Na+ jest zawsze wyższe w płynie zewnątrzkomórkowym, a K+ wewnątrz komórki.

Tworzy się gradient stężeń jonów K i Na po obu stronach trofoblastu, dochodzi do aktywnego transportu jonów Na i K i wnikania wody drogą osmozy do jamy blastocysty.

Gromadzenie się płynu wraz ze wzrostem liczby blastomerów powoduje intensywny wzrost zarodka.

7. Wylęganie się blastocysty

Pod wpływem enzymów (np. pronaza), estrogenów i ruchów zarodka w zp powstaje szpara (około ½ średnicy blastocysty), osłonka pęka wskutek powiększającej się blastocysty i ciśnienia płynu w jamie, pierwsze wychodzą komórki TE

Implantacja – w ścianie macicy, bydło 28-45 dzień, świnia 12-26 dzień

Wydłużanie się blastocysty – bardzo szybki wzrost przed implantacją, zarodek świni może osiągać długość nawet do ok. 1m.