prep biomol skrypt9

Przed rozpoczęciem izolacji kolumnę należy ekwilibrować poprzez przepuszczenie przez złoże 10 objętości kolumny (CV) buforu startowego. Procedura izolacji przebiega następująco:

1)    Na ekwilibrowane złoże nanieść 5 ml próby. Po wsiąknięciu w żel przemyć złoże 5 ml buforu startowego.

2)    Eluować kolejno 6 ml roztworów zawierająch 10%, 40% i 100% buforu elucyjnego Zbierać 2 ml frakcje do osobnych probówek

3)    W uzyskanych frakcjach oznaczyć zawartość białka i aktywność enzymu według metod

podanych niżej.

4)    Sporządzić tabelę oczyszczania białka enzymatycznego.

Oznaczanie zawartości białka metodą biuretową:

1)    W probówce umieścić 0,05 ml roztworu białka, dodać 2,45 ml 0,85% NaCl. Do prób kontrolnych zamiast białka odmierzyć 0,05 ml odpowiedniego buforu.

2)    Dodać 2,5 ml odczynnika biuretowęgo

3)    Po wymieszaniu i 30 - minutową inkubacji kolorymetrować wobec próby ślepej przy długości fali 540 nm.

Oznaczanie aktywności fosfatazy kwaśnej

1)    Odmierzyć do probówki 0,55 ml roztworu substratu fosfatazy kwaśnej

2)    Dodać do prób właściwych po 0,1 ml próby, do prób kontrolnych po 0,lml 0,85% NaCl.

3)    Inkubować przez 15 minut w temperaturze +37 °C.

4)    Do wszystkich prób dodać po 2 ml 0,1 N NaOH. Próby właściwe kolorymetrować wobec odpowiednich kontrolnych przy 410 nm.