prep biomol skrypt
0

Ćwiczenie 3.

( hmmatografia powinowactwa białek plazmy nasienia knura wiążących jony Z,n^:+ na Chelating Sepharose Fast Flow oraz Ig(i na złożu Protein A Scpliarose

Chromatografia powinowactwa

Chromatografia powinowactwa jest szczególnym typem chromatografii adsorpcyjnej, w której wykorzystuje się wzajemne powinowactwo dwóch substancji. Ze względu na swe unikalne właściwości pozwala znacznie uprościć procedurę izolowania wybranej substancji, przy jednoczesnym zachowaniu jej biologicznej aktywności

Interakcja substancji rozpuszczonej w fazie ruchomej z unieruchomionym ligandem może mieć różny charakter, może to być oddziaływanie pomiędzy: hormonem a receptorem,

-    enzymem a substratem, przeciwciałem a antygenem łub haptenem, komplementarnymi odcinkami kwasów nukleinowych, kwasami nukleinowymi a białkami,

-    lektynami a glikoproteinami,

-    dopełniaczem a przeciwciałami z grupy IgG itp.

Chromatografię powinowactwa przeprowadza się zwykle w dwóch etapach. W pierwszym etapie przez kolumnę przepuszcza się materiał zawierający cząsteczki komplementarne do ligandu. Przemieszczające się w obrębie złoża cząsteczki odnajdują unieruchomiony Jigand i wiążą się z nim. Po wymyciu nieswotśde zaadsorbowanych cząsteczek rozpoczyna się drugi etap, w którym dochodzi do dysocjacji powstałych kompleksów i elucji swoiście związanych makromolekuł.

Dysocjacji kompleksów można dokonać w różny sposób. Można zastosować specyficzny eluent zawierający kompetytor współzawodniczący o miejsca wiążące z ligandem. Można jednak eluować związane substancje w sposób niespecyficzny, za pomocą buforów o niskiej lub wysokiej wartości pH (np. bufor octanowy, bufor węglanowy itp.), roztworów o wysokiej sile jonowej (2,5 M roztwór NaCl) czy związków rozrywających wiązania wodorowe (4-8 M roztwór mocznika, 6 M roztwór guanidyny). Po zakończeniu elucji należy usunąć zastosowane w tym celu substancje od wyizolowanych makromolekuł. Można to zrobić różnymi metodami, np. stosując dializę, ultrafiltrację lub filtracje żelową.