prep biomol skrypt5

Wykonanie

1.    Kolumnę zamocować pionowo w statywie.

2.    Przygotować bufor 0,5 M Tris HCI pH 8,0.

3.    Przygotować odpowietrzony roztwór Sephadexu

4 Napełnić kolumnę zawiesiną żelu. Rozpocząć przy zamkniętym wypływie. Następnie otworzyć zawór i dodawać sukcesywnie zawiesinę w miarę wypływu eluentu. Podczas napełniania kolumny eluent powinien przykrywać powierzchnię żelu, nie można bowiem dopuścić do zapowietrzenia kolumny.

5. Po napełnieniu kolumny do ok. 4 cm od górnej krawędzi, zamknąć zawór wypływu.

6 Wyciąć z bibuły krążek o wymiarze średnicy wewnętrznej kolumny i nałożyć go na powierzchnię żelu

7.    Ustawić odpowiednią szybkość przepływu eluentu przez kolumnę regulując wysokość ustawienia zbiornika z eluentem wobec kolumny (Rys. 4).

8.    Ściągnąć płyn znad krążka bibuły za pomocą strzykawki z wężykiem, a następnie nanieść 1 ml próby (mieszanina zawierająca substancje o znanych masach cząsteczkowych).

9.    Otworzyć zawór wypływu, a po wsiąknięciu próby w żel ponownie zamknąć.

10.    Strzykawką wlać eluentu aż po górną krawędź kolumny.

11.    Kolumnę zamknąć przykrywką i podłączyć ją do zbiornika eluentu.

12.    Podłączyć kolektor frakcji wyposażony w odpowiednią ilość probówek.

13.    Uruchomić zestaw chromatograficzny i zbierać frakcje o określonej objętości.

Rys. 4 Ciśnienie robocze eluentu mierzone: A - między powierzchnią eluentu w kolumnie a końcem rurki wylotowej, B - między powierzchnią eluentu w zbiorniku a końcem rurki wylotowej, C - od spodu rurki wylotowej powietrza (w butli Mariotte’a) do końca rurki wylotowej.