prep biomol skrypt
8

Rozdział ełektroforetyczny plazmy nasienia na aktywność dysniutazy ponadtlenkowcj i inhibitorów akrosyny

>    elektroforezę przeprowadzić w 7,5% żelu poliakryloamidowym w rurkach szklanych (przygotowane)

>    rurki umieścić w aparacie do elektroforezy, naczynia elektrodowe wypełnić 0,05 M buforem TRIS-glicyna, pH 8,3, a następnie na każdy żel nanieść badaną próbę obciążoną kryształkami sacharozy

>    nanieść 200 pl próby na każdą rurkę.

Po zakończeniu elektroforezy żele wybarwić na aktywność:

-    dysniutazy ponadtlenkowej

Przygotowanie mieszanin barwiących:

Roztwór A) ImM błękit nitrotetrazołiowy (NBT)

Roztwór B) 28 mM TEMED i 28 pM ryboflawina w 36 mM buforze fosforanowym, pH 7,8 Procedura barwienia:

>    Żele inkubować w ciemności przez 20 min w roztworze A, a następnie przez 15 min w roztworze B, naświetlając równomiernie żele światłem słonecznym lub pod lampą UV Żel barwi się na fioletowo; rejony zawierające SOD pozostają niezabarwione.

-    inhibitory akrosyny:

Odczynniki:

1.0.1M bufor fosforanowy pH 7,4

2.    0,05 M bufor fosforanowy pH 7,4

3.    trypsyna

4.    acetyl-DL-phenylalanine-{i-naphthyl ester (substrat)

5.    tetrazotized orto-diamzide (barwnik)

6.    dimethyl formamide (rozpuszczalnik)

7.    2% kwas octowy

Bezpośrednio przed barwieniem przygotować:

-    roztwór trypsyny (4mg na 100 ml 0,1 M buforu fosforanowego)

-    mieszaninę barwiącą:

a)    20 mg substratu rozpuścić w 8 ml rozpuszczalnika,

b)    40 mg barwnika rozpuścić w 80 ml 0,05M buforu fosforanowego.

Zmieszać roztwory a i b.