prep biomol skrypt8

Wykonanie:

1)    Przemyć kolumnę 5 mi buforu A. Nie dopuścić do zapowietrzenia kolumny przed naniesieniem próby.

2)    Umieścić pod kolumną probówkę. Nanieść 1 ml próby na złoże. Przemyć 1 ml buforu A. Uzyskaną frakcję nie związaną z kolumną zebrać do probówki.

3)    Kolumnę przemyć ponownie 5 ml buforu A, Po przemyciu osuszyć kolumnę przez pozostawienie jej przez 2 min. przy otwartych zaworach podciśnieniowych,

4)    Wstawić pod kolumnę nową, czystą probówkę. Na osuszone złoże nanieść 0.5 ml buforu B. Bardzo powoli przepuszczać bufor przez złoże (wskazane jest pozostawienie go na złożu na okres 1-2 min). Osuszyć kolumnę (patrz pkt. 3).

5)    Uzyskane frakcje podpisać i zachować do analiz elektroforetycznych.

Zastosowanie chromatografii jonowymiennej do izolacji białek

Izolacja fosfatazy kwaśnej plazmy nasienia knura z wykorzystaniem technik chromatografii jonowymiennej

Celem ćwiczeń jest izolacja enzymu z wykorzystaniem złóż jonowymiennych (DEAE Sepharose i S-Sepharose), a następnie ocena skuteczności procedury na podstawie zmierzonej zawartości białka i aktywności enzymu. Ćwiczenie wykonać z wykorzystaniem kolumn z przepływem grawitacyjnym oraz systemów chromatograficznych FPLC i BioPilot. W przypadku systemów chromatograficznych zastosować podczas elucji gradient liniowy.

Przygotować bufory:

DEAE Sepharose:

Bufor startowy: 25 mM TRIS-HC1, pH 8,5

Bufor elucyjny: 25 mM TRIS-HCI, 0,5 M NaCl, pH 8,5

S-Sepharose:

Bufor startowy: 50 mM Na-octan pH 5,0

Bufor elucyjny: 50 mM Na-octan, 1.0 M NaCl, pH 5,0

W przypadku kolumn z przepływem grawitacyjnym należy przygotować po 10 ml roztworów buforowych zawierających

1)    10% bufom elucyjnego

2)    40 % bufom elucyjnego