prep biomol skrypt
7

Akrosyna (EC 3.4.21.10) to najbardziej aktywny enzym akrosomu plemnika. Wystypuje on w formie zymogenu proakrosyny stanowiącego kompleks akrosyna-inhibitor akrosyny Akrosyna ułatwia przejście plemnika przez osłonię przejrzystą jaja. Mechanizm jej działania polega prawdopodobnie na hydrolizie wiązań arginylowych i lizynowych osłonki, co powoduje zmiany konformacyjne receptorów tej osłonki i zapobiega polispermii. W reakcji tej współdziałają inhibitory akrosyny obecne w plazmie nasienia.

Syntetyzowane są w gruczołach pęcherzykowych oraz częściowo w najądrzach. Inhibitory plazmowe, w przypadku plemników ejakuiowanych, znajdują się na powierzchni plazmolemy. Są więc naturalnymi antagonistami akrosyny, funkcjonalnie odpowiedzialnymi za aktywację lub uwalnianie tego enzymu w odpowiednim czasie i miejscu podczas wędrówki plemników w drogach płciowych samicy.

1. Rozdział elektroforetyczny plazmy nasienia i barwienie na aktywność fosfatazy kwaśnej Wykonanie:

-    żel rozdzielający 10% - przygotowany

>    przygotować żel zagęszczający w następujący sposób:

3,45 ml H2O

0,83 ml 30% roztworu akryloamidów 0,63 ml 1,0 M buforu TRIS pH 6,8

dodać katalizatory: 0,05 ml 10% APS i 0,005 ml TEMED i wylać żel.

-    przygotowanie prób:

>    plazmę nasienia uprzednio wydializowaną wobec wody zmieszać w stosunku 1:1 z buforem obciążającym bez SDS

>    na żel nanosić 10 pl próby.

Procedura barwienia:

Roztwór barwiący:

25 mg (3-naftylofosforanu 50 mg Fast Black k

rozpuścić w 100 ml 50 mM buforu octanowego pH 5,0 i przesączyć. Roztwór przygotować tuż przed barwieniem.

Wykonanie:

>    Zalać żel 50 ml barwnika i wstawić na 5 min do cieplarki o temp. 37°C. Następnie zlać płyn i zalać pozostałą częścią barwnika. Wstawić do cieplarki na 20-30 min. Odbarwiać 7% kwasem octowym.