prep biomol skrypt3

rozmiary ziarna żelu tym mniejsze są opory przepływu aJe tym gorsza jest też uzyskiwana rozdzielczość. Jednak im mniejsze są rozmiary porów w ziarnie żelu, tym mniejsze molekuły białkowe mogą być skutecznie rozdzielane przy jego zastosowaniu.

3. Sączenie molekularne

Sączeniem molekularnym lub filtracją żelową (ang Gel Filtration Chromatography -GFC) nazywamy metodę służącą do separacji składników jednorodnych mieszanin na podstawie różnic mas cząsteczkowych. W metodzie tej wykorzystuje się porowatą strukturę ziaren żelu oraz zjawisko dyfuzji, któremu podlegają zarówno cząsteczki solwentu (rozpuszczalnika) jak i rozdzielane makrocząsteczki Zasada rozdziału opiera się na różnicach w szybkości przepływu substancji przez kolumnę wypełnioną złożem, co wynika głównie z różnic w ich masach cząsteczkowych. Duże cząsteczki przepływają przez kolumnę szybciej. Przepływ substancji drobnocząsteczkowych jest wolniejszy, ponieważ wnikają one w pory ziaren żelu (Rys. 1).

^płytka

porowata

UftfiSŚsl—

eluent

OTJaOTO

OOO

OOOO

OOO

OOOO

OOO

OOO

OOOO

OOO

JonO

T

Rys. i Schemat sączenia molekularnego w kolumnie: A - faza naniesienia mieszaniny na kolumnę, B - faza rozdziału, C - faza końcowa rozdziału 4. Kalibracja kolumny

Proces ten polega na określeniu czasu retencji lub objętości elucji dla danej molekuły i przyporządkowanie im określonej masy cząsteczkowej Zależność objętości elucji od mas cząsteczkowych makromolekuł należy dla danej kolumny wyznaczyć doświadczalnie. Czynność tę przyjęto nazywać kalibracją kolumny. Raz przeprowadzona kalibracja kolumny zachowuje swoją ważność tylko dla warunków separacji identycznych z tymi, które panowały w trakcie kalibracji. Jeśli zmianie ulegnie złoże w kolumnie, rodzaj solwentu, temperatura kolumny łub prędkość przepływu eluentu, to kolumnę należy kalibrować od nowa. Sam proces kalibracji polega na dokonaniu separacji mieszaniny cząsteczek o dobrze zdefiniowanych właściwościach (głównie masę cząsteczkowej) i przyporządkowaniu im ndnnwieHnirJt nilrów