prep biomol skrypt
3

Ćwiczenie 4

< 'li    rafia fiydrufuhowa (HIC) i ml wróconej fazy (Kł’< I

w oc/yszc/aniii białek

Chromatografia hydrofobowa (HIC)

Technika ta jest szeroko wykorzystywana do separacji i oczyszczania makrocząsteczek białkowych. Białka adsorbowane są na złożu dzięki występowaniu oddziaływań hydrofobowych fragmentów białka z hydrofobowymi ligandami złoża chromatograficznego. Spośród wielu czynników mających wpływ na wiązanie białek szczególne znaczenie ma rodzaj i stężenie soli w buforze startowym. Sól, powodując odwodnienie cząsteczek białkowych wymusza ich interakcje z Ugandami unieruchomonymi na złożu. Najczęściej stosowaniymi solami w tym rodzaju chromatografii są siarczany sodu, potasu i amonu. Po związaniu, białka eluuje się ze złoża stosując bufory o niższym stężeniu soli.

а)    Oczyszczanie hemoglobiny na złożach do chromatografii interakcji hydrofobowych.

W ćwiczeniu wykorzystane zostaną złoża upakowane w kolumnach typu HiTrap (Amersham) umożliwiające przeprowadzenie rozdziałów z wykorzystaniem strzykawek. Wykorzystane zostaną złoża zawierające reszty oktyłowe, fenylowe i butylowe.

1)    Przygotowanie próby : do 0,5 ml roztworu hemoglobiny dodać 0,5 ml 2M siarczanu amonowego. Próbę dokładnie wymieszać, a następnie odwirować przez 5 minut przy 12 000 obr/min.

2)    Przy pomocy strzykawki, przemyć kolumnę chromatograficzną 5 ml I M siarczanu amonowego w 20 mM buforze fosforanowym (pH 6.8). Unikać zapowietrzenia kolumny.

3)    Przygotować po 10 ml roztworów zawierających 20, 40, 60 i 80 % buforu elucyjnego (20

mMNa₂HP0₄ pH 6.8).

4)    Po odwirowaniu nanieść 1 ml próby na wyekwilibrowaną kolumnę chromatograficzną. Przemyć 5 ml buforu 1 M (NPL^SO^ 20 mM Na₂HP04 pH 6.8.

5)    Eluować (5 ml) przygotowanymi wcześniej buforami zawierającymi 20, 40, 60, 80 i 100 %

buforu elucyjnego. Zbierać frakcję wypływające z kolumny do osobnych probówek.

б)    Zregenerować kolumnę przez przemycie 30 % izopropanolem (5 ml), a następnie H₂0 destylowaną,

6)    Przeprowadzić analizę uzyskanych wyników.