prep biomol skrypt
1

Izolowanie białek wiążących jony metali

Większość cząsteczek białkowych w różnym stopniu oddziałuje z jonami metali. Siła tego oddziaływania uzależniona jest od struktury przestrzennej cząsteczki (domeny wiążące jony metali), od zawartości reszt aminokwasowych, które bezpośrednio mogą wiązać jony metali (histydyna, tryptofan i cysteina) oraz od pH otoczenia (optimum w przedziale 6-8),

Elucja specyficznie zaadsorbowanego materiału możliwa jest przez obniżenie pH i jednoczesne podwyższenie siły jonowej eluatu lub zastosowanie do elucji silnego chelatora jonów dwuwartościowych (EDTA)

U podstaw tego rodzaju chromatografii powinowactwa leży możliwość odwracalnego wiązania (chelatowania) jonów metali przez specjalnie przygotowany nośnik. Związane ze złożem jony metali (Zn, Cu, Cd, Hg, Co lub Ni) mogą z kolei specyficznie adsorbować peptydy i białka wykazujące z nimi powinowactwo. Należy spodziewać się, że w trakcie przepuszczania przez kolumnę związaniu ulegną te białka, które wykazują powinowactwo do jonów dwuwartościowych.

W wyniku zastosowania eluentu o narastającej sile jonowej i malejącej wartości pH, dojdzie do selektywnego wymywania tych cząsteczek, które w zmieniających się warunkach zmieniają swa konformację w ten sposób, że zmienia się ich ładunek powierzchniowy i zdolność wiązania jonów metali. Cząsteczki które zostały związane bardzo silnie z jonami i nie podlegały elucji w warunkach niskiego pH, mogą być usunięte z kolumny wraz z jonami przez zastosowanie silnego chelatora jakim jest EDTA.

Izolacja białek wiążących jony Zn² z plazmy nasienia knura z zastosowaniem systemu chromatograficznego „BioPilot”

Przygotować bufory:

A)    Bufor 0,05 MTris-HCI(pH 9,1)

B)    Bufor 0,05 M Tris-octan (pH 8,0); 0,5 M NaCl

C)    Jony Zn²⁺, w stężeniu 30 pM Zn²7cm złoża, przy użyciu ZnCl

D)    Bufor 0,05 M Tris-HCI (pH 7,0); 0,1 M imidazol

E)    Bufor 0,05 M Tris-octan; 0,5 M NaCl; 0,05 M EDTA

Wykonanie:

1.    Plazmę nasienia dializować wobec buforu A przez 24 godziny w temp. 4^<5C. Po dializie

próbę odwirować przez 15 minut przy 10 000 x g w temp. pokojowej. Osad odrzucić, a supematant nanosić na kolumnę chromatograficzną

Rozdział przeprowadzić przy pomocy systemu chromatograficznego „BioPilot” wykorzystując złoże Chclating Sepharose Fast Flow (Amersham Biosciences).

2.    Na początku każdego rozdziału złoże zrównoważyć buforem B.