prep biomol skrypt
2

3 Po zrównoważeniu złoże wysycić jonami Zn²⁴.

4.    Po naniesieniu jonów Zn²' złoże zrównoważyć ponownie w warunkach opisanych uprzednio.

5.    Na przygotowane w ten sposób złoże nanieść wydializowaną plazmę nasienia o stężeniu białka (20-50 mg/ml).

6.    Białka związane z jonami Zn²⁺ wymywać ze złoża buforem D.

7.    Zbierać eluowane frakcje o absorbancji (UV) powyżej 0,2 przy długości fali 280 nm.

8.    W końcowym etapie złoże zregenerować buforem E.

Izolacja IgG na złożu Protein A Sepharose.

Białko A (Protein A) ma masę cząsteczkową 42 tys. i zostało wyizolowane z bakterii Staphylococcus aureus. Wykazuje powinowactwo do fragmentu Fc cząsteczki IgG, pozostawiające miejsca wiążące antygeny wolne. Jedna cząsteczka immobilizowanego białka A może wiązać dwie cząsteczki IgG.

Złoże stosowane do izolacji ma zdolności wiązania około 20 mg ludzkich IgG na 1 ml że) u Elucja następuje przez obniżenie pH.

Wykonanie:

Bufor startowy (A): 20 mM fosforan sodu pH 7.0 (lub PBS, TRIS)

Bufor ełucyjny (B): 0,1M kwas cytrynowy pH 3.0 (lub kwas octowy)

1.    Przemyć kolumnę 5 ml buforu startowego (A).

2.    Nanieść 1 ml 10-krotnie rozcieńczonej surowicy krwi (100 pi surowicy krwi + 900 pl buforu startowego)

3.    Przemyć złoże 5 ml buforu startowego.

4.    Przemyć złoże 5 ml buforu elucyjnego (B). Zbierać 1 ml frakcje do probówek, do których przed elucją należy odmierzyć po 0,1 ml 1 M Tris-HCl, pH 9.0. Dokonać pomiaru absorbancji przy 280 nm. Próby zachować do analiz elektrofbretycznych.