prep biomol skrypt7

Ćwiczenie 2.

Wstępne oczyszczanie białek różnymi technikami chromatograficznymi oraz określenie pi białek przy użyciu kolumn Bakcrhoiul SPE

Technika ekstrakcji z fazy stałej (Solid Phase Extraction, SPE) opiera się na specyficznych interakcjach między stałym sorbentem (złożem) a substancjami rozpuszczonymi w roztworach. Jednym z najważniejszych celów w postępowaniu izolacyjnym jest koncentracja i wstępne oczyszczenie preparatu z zanieczyszczeń, które mogą uniemożliwiać przeprowadzenie oznaczeń analitycznych. W dodatku zanieczyszczenia te mogą wykluczać zastosowanie technik kolumnowej chromatografii cieczowej, a nawet spowodować zniszczenie złoża chromatograficznego. Zastosowanie techniki SPE umożliwia przygotowanie próby do dalszych etapów postępowania metodycznego bez stosowania innych metod takich jak wirowanie, filtracja, destylacja, precypitacja czy liofilizacja.

Celem ćwiczenia jest rozdział białek ptazmy nasienia knura na kolumnach Bakerbond SPE przy wykorzystaniu chromatografii jonowymiennej, interakcji hydrofobowych i odwróconej fazy.

Wykorzystywane złoża:

CBX (carboksylic acid) - chromatografia jonowymienna, kationit PEI (polyethyleneimine) - chromatografia jonowymienna, anionit HI - propyl (C3) - chromatografia interakcji hydrofobowych Butyl (C4) - chromatografia odwróconej fazy

Bufory do adsorbcji i ełucji białek na poszczególnych złożach

	CBX	PEI	IH-Propyl	Butyl
Bufor A	50 inM Na-octan, pH 5.0	20 mM Tris-HCl, pH 8.5	1.0 M (NH^SO* 50mM fosforan, pH 7.0	50mM fosforan, pH 7.0
Bufor B	50 mM Na-octan, 1.0 M Nad, pH 5.0	20 mM Tris-HCl, 0.5M NaCL, pH 8.5	50 mM NH4-octan, pH 7.0	50mM fosforan, 60% izopropanoł, pH 7.0