prep biomol skrypt
6

Obecnie najbardziej rozpowszechnionym systemem SDS-PAGE jest układ wg Laemmli (1970). W układzie tym rozdzielane białka ulegają zagęszczeniu w żelu górnym (zagęszczającym), przed wejściem w żel dolny (rozdzielający), co znacznie podnosi rozdzielczość tej metody. Dodatkową modyfikacją tej metody może być użycie w roztworach żeli 10% glicerolu oraz wyższego pH buforu żelu rozdzielającego, co również podnosi jakość rozdziału. W trakcie elektroforezy dochodzi, szczególnie przy wyższych wartościach napięcia i natężenia, do wydzielania ciepła co prowadzi do podwyższenia temperatury i zmiany warunków rozdziału Aby tego uniknąć wskazane jest używanie chłodzenia Żele poliakryloamidowe stosowane w elektroforezie PAGE posiadają lepszą rozdzielczość niż podłoża agarozowe. W trakcie formowania żelu monomery akryloamidów polimeryzują (łączą się ) w długie nici połączone poprzecznie przez N, N’-metyleno-bisakrylamid, co tworzy u sieciowaną, porowatą strukturę.

PRZYGOTOWANIE ŻELU

1.    Wymieszać odpowiednią ilość odczynników (wg tabeli I) w celu uzyskania roztworu akryloamidów o określonym stężeniu i potrzebnej ilości dla żelu rozdzielającego (można uwzględnić 10% stężenie glicerolu). Uwaea! Nie dodawać katalizatorów -nadsiarczanu amonu (APSI i TEMEDu.

2.    Dodać katalizatory.

3.    Wylać żel między szyby aparatu elektroforetycznego

4.    Górną warstwę żelu zalać delikatnie wodą, w celu uzyskania równej powierzchni.

5.    Po polimeryzacji żelu rozdzielającego (ok. 30 min.) opłukać i osuszyć bibułą jego powierzchnię i wylać na nią roztwór żelu zagęszczającego (przygotowany jw.wg punktu 1-3, tab. 2).

6.    Wstawić grzebień w żel zagęszczający.

7.    Po polimeryzacji żelu zagęszczającego do komór aparatu wlać bufor elektrodowy.

8.    Studzienki żelu zagęszczającego przepłukać buforem elektrodowym, a następnie nanieść próby. Podłączyć napięcie, tak aby anoda (+) była w komorze dolnej.

9.    Wybarwić, a następnie poddać skanowaniu densytometrycznemu.