prep biomol skrypt
4

b)    Rozdział surowicy ki-wi na złożu Phenyl Sepharosc HP z wykorzystaniem systemu FPLC

1)    Przygotowanie próby: 0,05 mi surowicy zmieszać z 1,1 ml buforu 1 M (NFU^SOa, 20 mM Na₂HP04 pH 6.8. Wymieszać, odwirować przez 5 minut przy 12 000 obr/min

2)    Nanieść próbę o objętości ) ml na kolumnę podłączoną do systemu FPLC.

3)    Przeprowadzić rozdział chromatograficzny zbierając frakcje o objętości 1 ml Przeprowadzić analizę uzyskanych wyników.

Chromatografia odwróconej fazy (RPC)

Podstawą separacji , podobnie jak w chromatografii oddziaływań hydrofobowych są interakcje między hydrofobowymi rejonami białka a hydrofobowymi ligandami żelu W praktyce jednak te dwie techniki znacznie się różnią. Złoża do RPC charakteryzują się znacznie większą gęstością powierzchniową łigandów łigandów, na skutek czego dochodzi do wiełopunktowego wiązania cząsteczki białka. W technice RPC stosuje się ligandy alkilowe o długości od 4 do 18 atomów węgla. Tęgo typu interakcje wymagają zastosowania do elucji rozpuszczalników organicznych, które mogą w wysokich sężeniach wpływać na konformację i aktywność biologiczną białek. Technika ta oferuje jednak w zamian możliwość uzyskania bardzo wysokiej rozdzielczości.

c)    Oczyszczanie przeparatu hemoglobiny techniką chromatografii RPC.

W technice wykorzystane zostaną:

złoże - SOURCE 15 RPC (Amersham)

bufor startowy - H₂0 Mili Q z dodatkiem 0,1 % kwasu TFA

bufor elucyjny - acetonitryl z dodatkiem 0,1% TFA

1)    Przygotowanie próby: do 1 ml roztworu hemoglobiny dodać 0,1 ml 1% TTA. Wymieszać i odwirować próbę. Nanieść 1 ml do pętli w systemie FPLC.

2)    Przeprowadzić rozdział, zinterpretować wyniki, zastanowić się nad poprawą rozdzielczości