prep biomol skrypt2

Ćwiczenie 1.

Metody chromatograficzne. Przygotowanie kolumny, złoża i buforów do rozdziałów białek różnymi technikami izolacyjimni

Chromatografia - jest metodą rozdzielania składników jednorodnych mieszanin w wyniku różnego ich podziału między fazę ruchomą (eluent) i nieruchomą (złoże chromatograficzne) układu chromatograficznego.

Istotnym elementem układu chromatograficznego, jest kolumna chromatograficzna. Jest to cylindryczny pojemnik z jednym wejściem i jednym wyjściem, wypełniony porowatą substancją (złożem, żelem).

1. Wybór kolumny

W zależności od potrzeb i przeznaczenia stosowane są kolumny o różnych rozmiarach i różnym typie budowy. Przy wyborze kolumny należy kierować się jej rozmiarami oraz wytrzymałością mechaniczną złoża i obudowy.

Do filtracji żelowej potrzeba kolumn o możliwie największej długości. Im kolumna jest dłuższa tym lepsza uzyskujemy rozdzielczość, ale niestety odbywa się to kosztem czasu potrzebnego na dokonanie separacji.

W technikach adsorpcyjnych długość kolumny nie wpływa znacząco na jej selektywność, ale im krótsza kolumna tym niższym ciśnieniem można wymusić przepływ. Wyboru średnicy kolumny należy dokonać na drodze kompromisu między ilością potrzebnego złoża a objętością próby nanoszonej na kolumnę.

2.    Wybór złoża

Kolumna chromatograficzna jest wypełniona złożem czyli substancją porowatą, która umożliwia rozdział złożonych mieszanin. Złoża różnią się nie tylko rodzajem materiału użytego do ich przygotowania ale również rozmiarami ziaren żelu oraz porowatością. Parametry te wpływają na zakres mas cząsteczkowych separowanych białek, jak i na opory przepływu solwentów przez kolumnę. Złoża obecnie stosowane są oparte na następujących substancjach: dekstranie (syntetyczny, usieciowany polimer glukozy), agarozie (polisacharyd pochodzący z alg morskich), poliakryloamidach. Przykładowe nazwy to Sephadex, Sepharose, Sephacryl itp. Żele Sephadex są odpowiednio spreparowanymi chemicznie dekstranami, przez co liniowe cząsteczki polisacharydów tworzą silnie usteciowane trójwymiarowe agregaty.

Żele Sephadex znalazły szerokie zastosowanie ze względu na szybkość przeprowadzania m7/l7ish] oraz brak wnłvwn na rozdzielane snhstanrte Orrólnie iiimniar. im wieJrsze sa