prep biomol skrypt1

SEPARACJA y-CLOBULIN Z SUROWICY KRWI

Gamma - globuliny otrzymuje się na ogół przez kombinację frakcjonowania za pomocą soli i chromatografii kolumnowej. Wysalanie można przeprowadzić za pomocą stałego siarczanu amonowego albo używając nasycony roztwór tej soli doprowadzony do pH 7,0.

Przeprowadzić wytrącanie gamma-globulin stosując następującą procedurę:

1)    Umieścić w probówce eppendorfa 0,5 ml surowicy krwi.

2)    Dodać 0, 5 ml nasyconego roztworu siarczanu amonu.

3)    Odstawić na 10 minut w temp. pokojowej, a następnie wirować przez 10 minut przy 10000 obr/minulę.

4)    Supematant odrzucić, a uzyskany osad rozpuścić w 0,5 ml 0,85% NaCl. Powtórzyć punkty 2 i 3.

5)    Uzyskany osad rozpuścić w 1 ml 0,85% NaCl. Uzyskana w ten sposób frakcja zawiera około 95% y - globulin.

6)    Pobrać 0,1 ml rozpuszczonego osadu i dodać 0,9 ml 0,85% NaCl. Zmierzyć absorbancję roztworu przy 280 nm

Otrzymane po strącaniu siarczanem amonowym osady można przechowywać w lodówce, albo przystąpić do kolejnego etapu oczyszczania po uprzednim odsoleniu uzyskanego preparatu, które wykonać można techniką filtaracji żelowej albo dializy.

FRAKCJONOWANIE PLAZMY NASIENIA KNURA ACETONEM.

Ze względu na możliwość denaturacji białek podczas frakcjonowania rozpuszczalnikami organicznymi ćwiczenie należy wykonać używając schłodzonej do temp. +4°C plazmy nasienia i zmrożonego w —20°C acetonu. Wszystkie czynności należy wykonywać w miarę możliwości szybko unikając zbytniego ogrzania próby.

1)    Pobrać 0,5 ml schłodzonej do +4°C plazmy nasienia do probówki eppendorfa. Dodać 0,5 ml zmrożonego acetonu. Dokładnie wymieszać próbę przez kilkukrotne odwrócenie probówki.

2)    Wstawić probówkę na 15 minut do zamrażarki.

3)    Po wyjęciu odwirować próbę przy 10 000 x g przez 5 minut.

4)    Przenieść 0,5 ml supematantu do kolejnej probówki. Pozostałą część supematantu odrzucić. Osad rozpuścić w 0,5 ml PBS. Podpisać probówkę z rozpuszczonym osadem i zachować ją do analiz elektro foretycznych

5)    Do pobranego supematantu dodać 0,5 ml acetonu. Wstawić probówkę na 15 minut do zamrażarki. Po wyjęciu odwirować próbę przy 10 000 x g przez 5 minut. Supematant odrzucić, osad rozpuścić w 0,25 ml PBS, podpisać i zachować do analiz elektroforetycznych.