prep biomol skrypt
5

Ćwiczenie 5.

Rnzd/inl    ’k ji!a/m\ misicnin

nu'Tu(b|

elektroforezy \\ żelu

poli;ikrvlo;imi(l<in > iu. oznaczanie mas cząsteczkowych (SDS-PAt-i- ) oraz analiza densYioim‘i r\ e/.na elekt rolo rei; ranom

Elektroforeza jest procesem, podczas którego naładowane cząstki w roztworze (białka, kwasy nukleinowe) wędrują po przyłożeniu stałego pola elektrycznego. Ruchliwość cząsteczek w polu elektrycznym zależy od siły tego pola, ładunku, wielkości i kształtu białka, od siły jonowej, lepkości i temperatury środowiska w jakim odbywa się elektroforeza

Jako narzędzie analityczne elektroforeza jest metodą prostą, szybką i bardzo czułą. Metodę tę stosuje się do badań właściwości naładowanych cząstek (masa, punkt izoelektryczny) oraz jako technikę separacyjną.

Elektroforezę przeprowadza się z reguły formując żel poliakryloamidowy (środowisko rozdziału) w rurkach, między szybami (elektroforeza plackowa, kanapkowa) lub wykorzystując gotowe żele. Stałe podłoża do elektroforezy zmniejszają ruch cząsteczek i dyfuzję spowodowaną przez ciepło, umożliwiają dokumentację wyników przez barwienie po rozdziale.

Elektroforeza może przebiegać w układzie pionowym (rurkowa, płytowa) lub poziomym. W większości urządzeń do elektroforezy żele są montowane między dwiema komorami z buforem elektrodowym, w taki sposób że żel stanowi jedyne połączenie między komorami.

Białka są związkami amfoterycznymi, tzn. zawierają zarówno domeny kwaśne jak i zasadowe. Ich ładunek elektryczny jest zdeterminowany przez pH środowiska w jakim się znajdują. Każde białko ma typowy dla siebie ładunek zależny od liczby i rodzaju aminokwasów dostarczających grup aminowych i karboksylowych. Wartość pH roztworu, w którym przebiega elektroforeza musi być stała, dlatego używane roztwory powinny być zbuforowane aby zachować wartość ładunku i ruchliwość białek.

W ostatnich latach do metod elektroforetycznych w żelach poliakryloamidowych (PAGE) wprowadzono jako czynnik modyfikujący siarczan dodecylu sodu (SDS). Jest on anionowym detergentem, który denaturuje białka i okleja się wokół rozwiniętego łańcucha polipeptydowego. W obecności dodatkowego czynnika redukującego (2-merkaptoetanolu) i wysokiej temperatury białka ulegają rozwinięciu i przyłączają stałą ilość SDS na jednostkę długości łańcucha polipeptydowego. W efekcie uzyskują identyczną „gęstość ładunku elektrycznego” niezależnie od wielkości białka co powoduje, że poruszają się w polu elektrycznym z prędkością zależną od ich masy.