7862365978

EP 2 034 830 BI

5693761; i 6407213, deimmunizowane, lub w inny sposób modyfikowane, aby uczynić je efektywnie ludzkimi.

[0083]    W EP 239 400 (Winter i wsp.) opisano zmianę przeciwciał przez substytucję (w danym regionie zmiennym) regionów determinujących dopasowanie (CDR) z jednego gatunku na inny. Zazwyczaj regiony CDR innych niż ludzkie (np. mysich) przeciwciał są podstawione w odpowiednich regionach przeciwciała ludzkiego za pomocą technologii rekombinacji kwasu nukleinowego w celu wytworzenia sekwencji kodującej żądane podstawione przeciwciało. Mogą zostać dodane segmenty ludzkiego genu regionu stałego żądanego izotypu (zwykle gamma I dla CH i kappa dla CL) i geny humanizowanego łańcucha lekkiego i ciężkiego mogą być jednocześnie wyrażane w komórkach ssaczych, w celu wytworzenia rozpuszczalnego humanizowanego przeciwciała. Można również stosować inne sposoby humanizowania przeciwciał. Na przykład, inne sposoby mogą odpowiadać za trójwymiarową strukturę przeciwciała, pozycje regionu zrębowego, które są w trójwymiarowym sąsiedztwie do wiążących determinant i immunogenne sekwencje peptydowe. Patrz, np.

WO 90/07861; Pat. US nr 5,693,762; 5,693,761; 5,585,089 i 5,530,101; Tempest i wsp. (1991) Biotechno-logy 9: 266-271 i Pat. US nr 6,407,213.

[0084]    Niekiedy bezpośrednie przeniesienie CDR do ludzkiego zrębu prowadzi do utraty powinowactwa wiązania antygenu uzyskanego przeciwciała. Dzieje się tak, ponieważ w niektórych pokrewnych przeciwciałach pewne aminokwasy w regionach zrębowych oddziałują z CDR i wpływają w ten sposób na całkowite powinowactwo wiązania antygenu z przeciwciałem. W takich przypadkach krytyczne byłoby wprowadzenie "mutacji wstecznych" do regionów zrębowych przeciwciała akceptorowego w celu zachowania aktywności wiązania antygenu z pokrewnym przeciwciałem. Ogólne podejście wytwarzania mutacji wstecznych jest znane w dziedzinie. Na przykład, Queen i wsp. Qak wyżej), Co i wsp Proc. Nat. Acad. Sci. USA88 : 2869-2873(1991) i WO 90/07861 (Protein Design Labs Inc.) opisują podejście, które obejmuje dwa kluczowe etapy. Po pierwsze, ludzkie regiony zrębowe V wybiera się na podstawie analizy komputerowej dla optymalnej homologii sekwencji białkowej do regionu zrębowego V pokrewnego mysiego przeciwciała. Następnie modeluje się komputerowo trzeciorzędową strukturę mysiego regionu V w celu wizualizacji reszt aminokwasowych zrębu, które prawdopodobnie oddziałują z mysimi CDR i te mysie reszty aminokwasowe następnie nakłada się na homologiczny ludzki zrąb. W ramach tego dwuetapowego podejścia, istnieje kilka kryteriów projektowania humanizowanych przeciwciał. Pierwszym kryterium jest stosowanie, jako ludzkiego akceptora, zrębu z konkretnej - ludzkiej immunoglobuliny, który jest zwykle homologiczny do innej niż ludzka immunoglobuliny donorowej lub zastosowanie konsensusowego zrębu z wielu ludzkich przeciwciał. Drugim kryterium jest stosowanie aminokwasu donorowego innego niż akceptorowy, jeśli ludzka reszta akceptorowa jest rzadka, a reszta donorowa jest typowa dla ludzkich sekwencji w swoistej reszcie zrębu. Trzecim kryterium jest zastosowanie donorowej reszty aminokwasowej zrębu a nie akceptorowej w pozycjach bezpośrednio sąsiadujących z CDR.

[0085]    Można również stosować inne podejścia, jak opisano np. w Tempest, Biotechnology 9: 266-271 (1991). Zgodnie z tym podejściem, regiony zrębowe V pochodzące z łańcuchów ciężkich i lekkich, odpowiednio, NEWM i REI stosuje się do przeszczepiania CDR bez radykalnego wprowadzania reszt mysich. Zaletą stosowania tego podejścia jest to, że trójwymiarowe struktury regionów zmiennych NEWM i REI są znane z krystalografii rentgenowskiej, a zatem swoiste oddziaływania między CDR i resztami regionu zrębowego V można łatwo wymodelować.

[0086]    W pełni ludzkie przeciwciała monoklonalne, które wiążą się z VLA-1, mogą być wytwarzane, np. z użyciem ludzkich splenocytów napiętnowanych in vitro, jak opisano w Boerner i wsp. (1991) J. Immunol.

14