7862365979

EP 2 034 830 BI

147:86-95. Mogą one również być wytwarzane przez klonowanie typu repertoire cloning jak opisano w Persson i wsp. (1991) Proc. Nat. Acad. Sci. USA 88:2432-2436 lub w Huang and Stollar (1991) J. Immunol. Methods 141:227-236; also US Pat. No. 5,798,230. Duże nieimmunizowane ludzkie biblioteki prezentacji na fagu można również zastosować do izolowania przeciwciał o wysokim powinowactwie, które mogą być opracowywane jako terapeutyki dla ludzi przy użyciu standardowej technologii fagowej (patrz, np. Hoogenboom i wsp. (1998) Immunotechnology 4:1-20; Hoogenboom i wsp. (2000) Immunol Today 2:371-8; i US 2003-0232333). Inne sposoby wytwarzania w pełni ludzkich przeciwciał obejmują wykorzystanie zwierząt innych niż człowiek, które mają inaktywowane endogenne loci Ig i są transgeniczne dla nieprzearanżowanych genów łańcuchów lekkich i ciężkich ludzkiego przeciwciała. Takie zwierzęta transgeniczne można immunizo-wać a1 -I lub jej pożądanym fragmentem antygenowym, a następnie z komórek B wytworzyć pochodzące od nich hybrydoma. Sposoby te są opisane, np. w różnych publikacjach/patentach GenPharm/Medarex (Pało Alto, CA) dotyczących myszy transgenicznych zawierających ludzkie miniloci Ig (np. patent US 5,789, 650); różnych publikacjach/patentach Abgenix (Fremont, CA) odnoszących się do XENOMICE (np. patenty US 6,075,181; 6,150,584 i 6,162, 963; Green i wsp., Naturę Genetics 7: 13-21 (1994); i Mendez i wsp., 15 (2): 146-56 (1997)); i różnych publikacjach/patentach Kirin (Japonia) dotyczących myszy "transomic" (np. EP 843 961, i Tomizuka i wsp., Naturę Genetics 16: 133-1443 (1997)).

Wytwarzanie przeciwciał i białek

[0087]    Przeciwciała i inne białka tu opisane mogą być wytwarzane w komórkach prokariotycznych i eukariotycznych. W jednym wykonaniu przeciwciała (np. scFv) są wyrażane w komórce drożdżowej, takiej jak Pichia (patrz, np. Powers i wsp (2001) J. Immunol 251 Methods 251:123-35), Hanseula, lub Saccharomyces.

[0088]    Przeciwciała, szczególnie przeciwciała pełnej długości, np. IgG, mogą być wytwarzane w komórkach ssaczych. Przykładowe ssacze komórki gospodarza do wyrażania rekombinantów obejmują komórki jajnika chomika chińskiego (komórki CHO) (w tym komórki CHO dhfr-, opisane w Urlaub i Chasin (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216-4220, stosowane z markerem selekcyjnym DHFR, jak opisany np. w Kaufman i Sharp (1982) Mol. Biol. 159: 601-621), limfocytame linie komórkowe , np. komórki szpiczaka NSO i komórki SP2, komórki COS, K562 i komórki z transgenicznego zwierzęcia np. transgenicznego ssaka. Na przykład, komórka jest komórką nabłonkową sutka.

[0089]    Poza sekwencją nukleotydową kodującą domenę immunoglobulinową, rekombinowane wektory ekspresyjne mogą nieść dodatkowe sekwencje kwasu nukleinowego, takie jak sekwencje, które regulują repli-kację wektora w komórkach gospodarza (np. miejsca rozpoczęcia replikacji) i geny markerów selekcyjnych. Gen markera selekcyjnego ułatwia selekcję komórek gospodarza, do których wprowadzony został wektor (patrz np. patenty US nr 4,399,216; 4,634,665; i 5,179,017). Przykładowe geny markerów selekcyjnych obejmują gen reduktazy dihydrofolianowej (DHFR) (do zastosowania w komórkach gospodarza dhfr- z se-lekcją/amplifikacją na metotreksacie) i gen neo (do selekcji na G418).

[0090]    W przykładowym układzie do ekspresji rekombinowanego przeciwciała (np. przeciwciała pełnej długości lub jego fragmentu wiążącego antygen), rekombinowany wektor ekspresyjny kodujący zarówno łańcuch ciężki przeciwciała jak i łańcuch lekki przeciwciała wprowadza się do komórek CHO dhfr- za pomocą transfekcji za pośrednictwem fosforanu wapnia. W rekombinowanym wektorze ekspresyjnym geny łańcucha ciężkiego i lekkiego przeciwciała są funkcjonalnie połączone z elementami regulatorowymi - wzmacnia-czem/promotorem (np. pochodzącymi z SV40, CMV, adenowirusa i podobnych, takimi jak -element regula-

15